Faktor-faktor yang mempengaruhi inveksi virus bronkitis (IBV)
Bronkitis menular
Meskipun Bronkitis (IBV) adalah virus yang menyebabkan kerugian ekonomi yang cukup besar pada unggas, tanda-tanda klinis IB tidak spesifik. Oleh karena itu, perlu untuk menggunakan alat untuk mengidentifikasi Bronkitis (IBV) ketika ada masalah klinis di lapangan. Secara umum, IB dapat didiagnosis dengan mendeteksi virus itu sendiri (atau bagian dari itu) atau dengan respon antibodi spesifik. Pilihan tes diagnosis tes terbaik dan interpretasi selanjutnya mungkin sangat sulit dan membingungkan.
Faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan deteksi Bronkitis (IBV), menurut Artria
a) Waktu yang berlalu antara awal infeksi dan pengambilan sampel: saluran pernapasan bagian atas adalah situs utama replikasi IBV, yang diikuti viremia, menyebabkan virus menyebar ke jaringan lain. Semua tipe IBV dapat diisolasi dari saluran pernapasan atas, dengan konsentrasi tertinggi ditemukan di trakea selama 3 sampai 5 hari pertama pasca infeksi (pi). Setelah periode ini, titer virus turun dengan cepat pada minggu kedua, di bawah tingkat deteksi.
Faktor yang menyulitkan dari sudut pandang diagnosis adalah definisi organ mana dan berapa banyak burung pembawa virus (baik dari vaksin atau asal lapangan). Ada kemungkinan penjelasan untuk isolasi jangka panjang atau ekskresi balik dari virus yang diinokulasi, seperti infeksi silang terus menerus di antara kawanan yang terinfeksi atau yang divaksinasi. Dua situs utama dari persistensi virus adalah tonsil dan ginjal cecal.
b) Tingkat kekebalan ayam pada saat infeksi: Tingkat kekebalan yang didapat pada saat infeksi memiliki pengaruh tertinggi pada periode dan jumlah IBV yang dapat dideteksi. Kehadiran antibodi ibu tidak mengurangi tingkat isolasi ulang virus tantangan di trakea dan di ginjal setelah tantangan anak ayam berusia 2 hari.
c) Jumlah ayam sampel: mengambil sampel lebih sedikit dari yang dibutuhkan mengurangi kemungkinan mendeteksi infeksi IBV.
d) Pemilihan organ (sampel): Ketika gejala pernapasan akut lebih dominan, saluran pernapasan adalah tempat yang lebih disukai untuk pengumpulan sampel. Ginjal, amandel sekum, dan kloaka disampel lebih disukai ketika ada infeksi kronis atau infeksi pada ayam yang divaksinasi, seperti lapisan dan peternak, di mana sejumlah kecil virus diperkirakan ada di saluran pernapasan.
e) Kualitas sampel: Sampel harus didinginkan dengan cepat untuk menjaga viabilitas virus. Jika pembekuan atau pendinginan tidak memungkinkan, sampel harus dimasukkan ke dalam 50% gliserin, di mana IBV tetap dapat hidup selama beberapa hari.
f) Genetika burung: Beberapa penelitian menunjukkan bahwa aspek genetik dapat memengaruhi kerentanan terhadap IBV. Garis ayam yang berbeda menunjukkan kematian variabel setelah inokulasi IBV sendiri atau pada koinfeksi dengan E. coli.
g) Isolasi virus (penggandaan dan deteksi IBV menular): isolasi virus bisa melelahkan, memakan waktu, dan mahal. Selain itu, metode klasik isolasi mungkin memerlukan beberapa bagian dalam telur berembrio sampai kematian berembrio terjadi atau tanda-tanda lain terdeteksi dalam embrio.
IB adalah salah satu penyebab paling penting dari kerugian ekonomi dalam peternakan unggas, dan mungkin terkait dengan masalah pernapasan, nefritis, dan penurunan produksi dan kualitas telur. Namun, gejala-gejala ini tidak spesifik IB, dan oleh karena itu, alat diagnostik diperlukan untuk mengidentifikasi infeksi oleh IB ketika masalah klinis diamati di lapangan. Alat diagnostik ini dapat mencakup klasifikasi jenis yang diidentifikasi selama isolasi, dengan tujuan memilih program vaksinasi yang akan memberikan perlindungan terbaik terhadap kawanan.
Tinjauan tentang teknik diagnostik yang berlaku untuk IB dapat ditemukan di Di Fábio & Villarreal (2009).
DIAGNOSA TIDAK LANGSUNG
Deteksi antibodi
Infeksi oleh IBV dapat didiagnosis dengan deteksi atau dengan peningkatan titer antibodi spesifik IBV. Secara umum, pengambilan sampel serum berpasangan diperlukan untuk menghubungkan masalah klinis dengan infeksi IBV. Sampel pertama dikumpulkan pada awal penyakit dan sampel kedua, 4 minggu kemudian.
Beberapa faktor dapat mempengaruhi keberhasilan deteksi antibodi IBV, seperti usia pada saat infeksi / vaksinasi (tingkat respon humoral imun setelah infeksi atau vaksinasi dapat menurun ketika infeksi terjadi pada usia yang sangat dini, karena banyak anak ayam belum kompeten imun), adanya antibodi maternal pada saat infeksi / vaksinasi (ini dapat menunda atau mengurangi respon serologis terhadap vaksinasi atau infeksi); adanya kekebalan pada saat infeksi / vaksinasi (sensitivitas tes untuk mendeteksi antibodi mungkin jauh lebih rendah pada ayam yang divaksinasi dibandingkan dengan ayam yang tidak divaksinasi); jumlah ayam sampel (jumlah ayam yang harus disampel untuk mendeteksi serokonversi tergantung pada prevalensi penyakit dan sensitivitas uji); reaksi silang antara serotipe,
ELISA
Ini adalah metode imunoenzimatik dan otomatisasi memungkinkan deteksi dan titrasi antibodi dalam sejumlah besar sampel serum. Sebagian besar tes ELISA generik untuk IBV; dengan kata lain, mereka tidak membedakan serotipe. Hal ini disebabkan oleh kenyataan bahwa permukaan lempeng tempat reaksi antigen-antibodi terjadi diresapi dengan suspensi virus dalam bentuk lengkapnya. Reaksi positif ketika ada strain IBV. Ini mendeteksi IgG, dan karena itu, merupakan indikator kekebalan humoral, memungkinkan analisis pasca-vaksinasi dan respons infeksi (pada burung dewasa).
Pengujian netralisasi virus
Ini mendeteksi antibodi yang diproduksi oleh fraksi protein S1; dan karenanya, ini adalah tes khusus serotipe. Ini dapat dilakukan dalam kultur sel atau dalam kultur cincin trakea. Bacaan ini memiliki prinsip yang sama dengan isolasi virus dalam telur berembrio, kultur sel dan kultur cincin trakea, dengan kata lain, ia mendeteksi perubahan embrio, efek sitopatik, dan ciliostasis. Pengujian ini membutuhkan serum tanpa reaksi silang dengan serotipe lain. Antibodi penetral sangat spesifik dan bertanggung jawab untuk efek perlindungan serum. Mereka menargetkan antigen penting pada permukaan virus yang berperan dalam proses penyerapan sel. Kelemahan dari tes ini adalah kurangnya standarisasi di antara berbagai sistem netralisasi virus, sehingga sulit untuk membandingkan hasilnya di antara berbagai laboratorium.
Imunodifusi pada gel agar
Tes ini tidak memerlukan banyak peralatan, atau fasilitas khusus. Tes ini membutuhkan pemasukan serum kontrol positif untuk membedakan pita curah hujan non-spesifik dari pita curah hujan IBV spesifik. Meskipun tes ini cukup sederhana, itu tidak standar untuk IB (De Wit, 2000).
Tes penghambatan hemaglutinasi (HI)
IBV bukan hemagglutinating alami, dan membutuhkan perawatan sebelumnya dengan enzim tipe C fosfolipase untuk mengekspos hemagglutinin, yang membuat tes ini sulit dilakukan dan distandarisasi. Antibodi penghambat hemaglutinasi diinduksi terutama terhadap protein lonjakan S1. Tes HI biasanya mendeteksi antibodi pertama antara 1 dan 2 minggu setelah infeksi. Tes HI adalah serotipe spesifik ketika digunakan untuk mendeteksi antibodi setelah inokulasi tunggal.
Spesifisitas serotipe HI jauh lebih rendah setelah infeksi ulang IBV, terutama ketika serotipe kedua atau selanjutnya heterolog (De Wit, 2000).
DIAGNOSA LANGSUNG
Isolasi dalam telur berembrio
Efek khas yang disebabkan oleh IBV pada telur yang berembrio ayam adalah tanda paling klasik untuk diagnosis virus ini, dan telah berhasil digunakan sejak awal penelitian tentang IB.
Efek seperti itu termasuk dwarfisme embrio, keriting, pendarahan, dan kematian. Lesi bervariasi sesuai dengan sampel / jenis, dan intensitasnya meningkat seiring dengan meningkatnya jumlah saluran telur.
Dalam tes ini, telur berembrio ayam berumur 9 hingga 10 hari diinokulasi dalam rongga allantoidal dengan 0,1 hingga 0,2 mL sampel lapangan (maserat organ, konten enterik, apusan trakea dan kloaka, semuanya disiapkan sebagai suspensi, ditambah antibiotik). , dan disaring dalam membran porositas 0,22 m) dan diinkubasi lagi untuk jangka waktu hingga empat hari, setelah itu cairan allantoid dikumpulkan, dan dikirim ke saluran baru, dan kemudian embrio dianalisis secara morfologis. Titer IBV maksimum mencapai 1 hingga 2 hari setelah inokulasi (kecuali untuk sampel yang tidak beradaptasi dengan telur yang diembrio)
Telur ayam berembrio adalah model yang efektif untuk isolasi sampel lapangan IBV karena dapat digunakan dengan sebagian besar strain lapangan; Namun, kerugiannya adalah bahwa biasanya tiga bagian berturut-turut diperlukan untuk manifestasi lesi khas pada embrio, yang menunda diagnosis. Selain itu, isolasi dalam telur dapat dikurangi, misalnya, ketika IBV tidak aktif karena pengawetan yang buruk. Penyebab lain yang mungkin untuk kegagalan isolasi virus adalah koinfeksi dengan virus lain yang mencegah replikasi IBV dalam embrio.
Selain itu, jika spesifisitas yang lebih tinggi diperlukan, uji konfirmasi perlu dilakukan, seperti netralisasi virus atau transkripsi balik diikuti oleh reaksi berantai polimerase (RT-PCR).
Penanaman di cincin trakea
Teknik ini menggunakan cincin trakea embrio SPF pada 19 hingga 20 hari inkubasi. Cincin yang diperoleh dari embrio trakea ditempatkan secara individual ke dalam tabung reaksi yang berisi media kultur sel dan antibiotik, dan diinkubasi pada suhu 37 ºC dalam sistem budidaya berputar selama 48 jam, dan hanya cincin dengan motilitas siliaris silia lebih dari 50% yang digunakan.
Setelah periode ini, media biakan dihilangkan dan 0,1 mL suspensi sampel yang akan diuji ditambahkan, diikuti dengan 1 jam inkubasi untuk adsorpsi virus. Satu mL media kultur, kemudian ditambahkan, dan sampel diinkubasi lagi.
Pada 24, 48, 72 dan 96 jam setelah inokulasi, cincin trakea diamati dalam mikroskop optik terbalik, mengevaluasi motilitas siliaris, yang seharusnya berkurang karena replikasi IBV (Epiphanio et al ., 2002).
Meskipun ini adalah teknik pencegahan yang efisien, teknik ini memiliki kelemahan karena tidak peka terhadap sampel lapangan IBV yang tidak menghadirkan tropisme untuk saluran pernapasan, dan karenanya, dapat menghasilkan hasil negatif palsu.
Harus dipertimbangkan bahwa ciliostasis juga dapat diinduksi oleh banyak agen lain, yang membutuhkan konfirmasi IBV dengan metode spesifik lainnya.
Metode berdasarkan asam nukleat
Deteksi IBV berdasarkan bukti keberadaan RNA virus spesifik dengan teknik reaksi transkriptase balik diikuti oleh reaksi berantai polimerase (RT-PCR) telah meningkat pada tahun-tahun terakhir, karena keakuratannya untuk diagnosis dan klasifikasi jenis. Biaya implementasi dan pelaksanaannya yang rendah telah memungkinkan sejumlah besar laboratorium publik dan swasta untuk digunakan secara rutin.
Singkatnya, teknik RT-PCR pertama menghasilkan DNA dari IBV RNA menggunakan "probe" DNA kecil yang disebut primer. DNA yang dihasilkan, disebut DNA komplementer, diamplifikasi milyaran kali oleh reaksi rantai polimerase, menghasilkan fragmen DNA beruntai ganda, diukur berpasangan dari basa yang dibatasi oleh primer dan, kemudian, fragmen DNA spesifik dideteksi oleh elektroforesis.
Untuk melakukan diagnosis skrining menggunakan metode RT-PCR, wilayah genom yang sangat terawetkan dalam jenis patogen tertentu harus dipilih untuk memungkinkan primer memulai amplifikasi urutan spesifik yang ada dalam keragaman terbesar yang mungkin dari jenis agen terdeteksi. Dalam kasus IBV, daerah genom yang biasa digunakan untuk diagnosis skrining adalah gen yang mengkode nukleoprotein N dan daerah yang terletak di ujung genom IBV yang tidak mengkodekan protein apa pun, tetapi memiliki fungsi dalam replikasi protein. genom virus dan itu disebut 3 'wilayah yang tidak diterjemahkan (3' UTR). Dengan kata lain, RT-PCR yang menggunakan wilayah ini sebagai target dapat mendiagnosis hampir semua serotipe atau genotipe IBV. Namun, ini tidak memungkinkan membedakan sampel / galur IBV, yang membutuhkan pemilihan daerah yang memungkinkan mendeteksi perbedaan di antara sampel tersebut. Dalam hal ini, gen lonjakan S glikoprotein, yang spesifik dari setiap serotipe dan genotipe, dapat digunakan, karena protein ini adalah yang menderita tekanan seleksi tertinggi dari sistem kekebalan tubuh.
Oleh karena itu, dimungkinkan dalam RT-PCR untuk menggunakan primer yang menargetkan gen S untuk secara spesifik mendeteksi jenis IBV ini atau itu, atau yang menghasilkan DNA, yang memungkinkan diferensiasi dengan pengurutan DNA. Meskipun RT-PCR adalah teknik yang sangat sensitif dan spesifik, tes diagnosis viral konvensional dan rujukan tidak boleh diabaikan. Asosiasi hasil yang diperoleh dengan menggunakan teknik yang berbeda memungkinkan diagnosis yang lebih akurat dan obyektif. Selain itu, RT-PCR tidak membedakan partikel virus yang tidak menular.
Akhirnya, metode diagnosis laboratorium untuk deteksi IBV adalah wajib baik untuk mengukur kejadian virus ini, serta untuk menentukan strain IBV mana yang beredar di antara unggas Brasil untuk mencegah dan mengendalikan bronkitis infeksi.